Laboratorio de modelos animales y celulares

Enfocado al estudio de la actividad eléctrica de la función normal y patológica del sistema nervioso desde los niveles de actividad de campo (EG y EEG) y su correlación con la actividad unitaria neuronal y la transmisión sináptica, hasta el nivel celular y molecular. En este laboratorio se llevarán a cabo estudios “in vivo” en modelos animales agudos y con registros prolongados –en vigilia y en sueño. Igualmente, se desarrollarán los estudios “in vitro” para determinar la capacidad de las nanopartículas magnéticas acomplejadas a biomoléculas para el marcaje, focalización y la manipulación funcional de canales iónicos, receptores activados por ligando o por factores tróficos. Estos estudios son necesarios para la aplicación posterior de las nanopartículas en la experimentación animal y en la investigación biomédica. Este laboratorio consta de las unidades siguientes:

•  Unidad de modelos animales

UNE-HRyC: Dr. J.M. Gaztelu, M.Romero-Vives y J. Barios

En este laboratorio se desarrollarán:

1) la administración “in vivo” de las nanopartículas / nanohilos magnéticos, con detección de su dispersión.

2) la determinación de la viabilidad y condiciones de uso de las mismas en modelos animales de enfermedades del SNC para aplicaciones diagnósticas y terapéuticas.

3) la puesta a punto y evaluación de los sistemas de focalización no invasivos desarrollados junto con en el laboratorio de Bioinstrumentación.

4) la caracterización de respuestas neurales a estimulación periférica y cortical mediante pulsos eléctricos y/o magnéticos; el registro de las distintas respuestas a lo largo de la vía motora se efectuará utilizando dispositivos desarrollados en el laboratorio de Bioinstrumentación.

5) el estudio de la posible neurotoxicidad de las nanopartículas producidas en el laboratorio correspondiente, por análisis visual y espectral de registros de actividad de campo en hipocampo / corteza, que pongan de manifiesto actividad de tipo epileptiforme o desviaciones de sus patrones normales.

•  Unidad de modelos celulares

UNE-HRyC: Drs. D. González Nieto y L. C. Barrio Calvo

En este laboratorio se desarrollarán los estudios para determinar la capacidad y utilidad de la aplicación de las nanopartículas/ nanohilos a nivel celular y molecular. Ejemplos son: la validación de nanopartículas biocompatibles acomplejadas con moléculas específicas (anticuerpos, péptidos, drogas/fármacos) que reconozcan proteínas estructurales de la membrana celular (canales iónicos, receptores activados por ligando o por factores tróficos, antígenos de superficie), necesarios para el desarrollo de marcadores funcionales o/y de potenciales dianas terapéuticas, así como su posible manipulación mediante técnicas de focalización.

El laboratorio de modelos celulares consta de:

a) Cultivos celulares (líneas celulares, cultivos primarios) y sistemas de expresión heteróloga en oocitos de Xenopus.

b) Equipamiento de Biología Molecular para la realización de técnicas de DNA recombinante necesarias para el clonaje de genes, para mutagénesis de las proteínas o/y la introducción de epítopos en proteínas de interés. Construcción de vectores de expresión de genes para la transfección de líneas celulares. Detección y cuantificación de proteínas y su localización subcelular mediante inmuno-blot, coinmuno-precipitación, crosslinking, o/y biotinilización de proteínas de membrana celular.

c) Microscopia confocal para la localización subcelular de nanopartículas y su co-localización con proteínas de interés. Realización de estudios funcionales en tiempo real para el seguimiento de proteínas marcadas con nanopartículas. Monitorización de variables intracelulares (pH y calcio) y vías de señalización.

d) Citometría de flujo para la selección de subpoblaciones celulares marcadas con nanopartículas. Estudios de viabilidad/toxicidad celular.

e) Neurofisiología. Sistemas de microinjección intracelular de nanopartículas. Técnicas de electrofisiología de fijación de voltaje para el estudio de corrientes de canales iónicos o/y de receptores activados por ligando, y de "patch-clamp" para estudios de actividad unitaria.

f) Registro bioeléctrico de neuronas aisladas de molusco. Registro simultáneo de la actividad electrofisiológica de varias neuronas para la determinación de interacciones inter-neuronales en redes neuronales simples. Desarrollo de modelos físicos para la explicación de los efectos de interacción de la membrana con campos externos electromagnéticos estáticos y variables externos y demostración del efecto de reorientación espacial de los fosfolípidos y proteínas de la membrana debidas a sus propiedades de anisotropía diamagnética. Como consecuencia, los iones calcio son liberados induciendo efectos biológicos derivados de su función como moléculas mensajeras secundarias. Los efectos observados mediados por el calcio ha motivado la investigación de los efectos de los campos magnéticos a las células glia y sus interacciones con las neuronas. Estos resultados experimentales están proporcionando hipótesis de posibles efectos de la estimulación magnética del cerebro con campos de baja intensidad y frecuencias extremadamente bajas, motivando asimismo investigaciones adicionales y el estudio de sus posibles usos terapéuticos

g) La experiencia del punto anterior soporta con fuerza nuevas estrategias de investigación para el uso de marcadores magnéticos de células para determinar los efectos de campos aplicados en:

1.- La modificación de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica y la localización subcelular de eventos (en astrositos).
2.- Proliferación en estudios con células madre adultas y astrositos de glioblastomas.
3.- Estudio de proteínas en distintas fases del ciclo celular.
4.- Métodos para la medida de interacciones intercelulares y en componentes moleculares de la membrana plasmática.

h) Para los objetivos indicados en los dos puntos anteriores distintas metodologías serán desarrolladas: registros electrofisiológicos y patch clamp, exposición a campos magnéticos de un amplio rango de frecuencias e intensidades, métodos de cell-culture y culture-room; microscopía invertida microscopía electrónica, sistemas de imágenes y sistemas para la caracterización de campos magnéticos y localización de marcadores magnéticos y estructuras celulares.